Cancers 2023, 15, 2860. https://doi.org/10.3390/cancers15102860

      结直肠癌是世界范围内最常见的癌症之一，其转移和扩散常常难以预测且患者存活率极低。近期虽发展出了多种治疗结直肠癌的方法，如单克隆抗体、疫苗、检查点抑制剂、溶瘤病毒、Car-T细胞疗法，患者仍需尝试更多新型的疗法提升疗效。

      EpCAM（CD326）是免疫疗法中常用的靶标，是一种分子量为39-40kDa的人体细胞表面糖蛋白，且在多种器官的癌细胞如卵巢、乳腺、结直肠、前列腺、肺、胰腺中高度表达。EpCAM在40年前作为上皮抗原被发现，之后被归类为细胞粘附分子。EpCAM在结直肠癌生物学中至关重要：生存信号、运动性、分化、细胞繁殖、粘附、扩散等行为中均涉及EpCAM。不仅在上皮细胞，不同组织中的胚胎干细胞也可表达EpCAM。

     近期，有研究使用EpCAM AUA1抗体来探测肿瘤细胞循环，可应用于检测早期恶性上皮肿瘤。另外，EpCAM在发展抗癌疗法及单克隆或双特异性抗体免疫疗法中很有潜力。相关研究中，已经有学术报告使用单克隆抗体、双特异性抗体、免疫疗法、siRNA和Car-T靶向EpCAM。

     脂质体纳米颗粒（LNP）被Moderna和辉瑞两家生物医药公司应用于mRNA疫苗的递送。使用纳米颗粒递送药物有多重优点，例如较高的吸收率、溶解度、稳定性，可穿透血脑屏障、低毒性且副作用较小。

     在此报告中，Promab团队使用mRNA-LNP递送EpCAM-CD3双特异性抗体到肿瘤位置，激活T细胞杀死结直肠癌肿瘤。此研究以人源化AUA1抗体为基础，开发了3种不同形式的新型双特异性抗体。这三种抗体均只对EpCAM阳性Lovo细胞系有效，不影响EpCAM阴性Colo741细胞系。除此之外，他们设计了EpCAM-CD3 hFc mRNA，并包裹在脂质体纳米颗粒（LNP）中进行递送，该抗体在与T细胞结合后展现出较高的特异性和肿瘤杀伤力，并可分泌IFN-gamma对抗EpCAM阳性结直肠癌细胞系；且剂量越大，效果越明显。同时，Promab团队发现使用EpCAM-CD3 mRNA LNP转染的OVCAR-5、A1847和CD30癌细胞可分泌EpCAM-CD3抗体并附带细胞毒性。此外，将EpCAM-CD3 hFc mRNA-LNP在体外通过静脉注射T细胞递送到OVCAR-5移植肿瘤部位可极大程度的抑制肿瘤生长。这些数据为LNP递送及体外生成EpCAM-CD3抗体提供了良好的基础，对肿瘤的医学研究有一定的参考价值。

     本研究中使用微流控的方式生成mRNA-LNP。Promab团队将mRNA先溶解于100mM，pH为4的醋酸钠溶液中，作为水相；将脂质溶解于无水乙醇中，作为有机相。其中，脂质各组分SM102（Cayman），DSPC（Avanti），胆固醇（Sigma），DMG-PEG2000（Cayman）按照50:10:38.5:1.5的摩尔比例混合；两相（水相：有机相）按照3:1的流速比在PreciGenome NanoGenerator Flex-S系统中进行混合与包载。制备出的mRNA-LNP再用30-100kDa超滤膜纯化、浓缩。最终生成的mRNA-LNP的表征数据为：粒径 104nm；电位 -4.8mV；PDI 0.14；包封率为91.84.5%。

     PreciGenome的NanoGenerator产品采用微流控方法连续合成纳米颗粒。该系统已广泛应用于多种场景：除本文递送mRNA-LNP外，亦可生成其他脂质体、PLGA纳米颗粒等包载核酸药物、蛋白、多肽、小分子药物等。由于其对尺寸和形状的卓越控制，该技术比传统的工艺更具优势。

     NanoGenerator系列产品可细分为Flex、Pro和Max系列。Flex系列包含Flex-S和Flex-M，产量范围0.2-12mL，适合早期配方筛选和细胞动物实验；Pro产量2-200mL，附带自动清洗和自动去前废功能，适合临床前试验；Max产量100mL-1L，可做GMP认证，可做药物的大规模生产。